細胞(bao)培(pei)養三(san)種重要試(shi)劑總結大全！！！
檢碩科學器材（上海）有限公司
培養基(ji)
液體培養基(ji)貯存于(yu)4 oC 冰箱，避免光照，實驗進行(xing)前(qian)放在37 oC 水槽(cao)中溫熱。
液體(ti)培養基(加(jia)血(xue)清) 存放期(qi)為(wei)六(liu)個月，期(qi)間glutamine 可能會分解，若細胞生長(chang)不佳， 可以再添加(jia)適量(liang)glutamine。
粉末培養基配制(以1 升為例)：
3.1. 細胞培養基通常須添加10 % 血清，因(yin)此粉末(mo)培養基之(zhi)配制體(ti)積(ji)為900 ml，pH 為 7.2 - 7.4。NaHCO3 為另外(wai)添加，若將NaHCO3 粉末(mo)直接加入液體(ti)培養基中會造(zao)成 pH 之(zhi)誤差，或局部過堿。因(yin)此粉末(mo)培養基及NaHCO3 粉末(mo)應(ying)分別(bie)溶(rong)解后才混合(he)然后用CO2 氣體(ti)調整pH，而非用強酸(suan)(HCl)或強堿(NaOH)，因(yin)為氯離子對細胞生 長可能有影響，且貯(zhu)存時培養基的(de)pH 易發(fa)生改變。
3.2. 材料：
3.2.1. 純水(milli-Q 水或(huo)二次至三次蒸餾(liu)水，水品(pin)質非(fei)常(chang)重要) 3.2.2. 粉末培養(yang)基(ji)
3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019) 3.2.4. 電磁攪(jiao)拌器(qi) 3.2.5. 無菌血清瓶
3.2.6. 0.1 或(huo)0.2 mm無菌過濾膜(mo) 3.2.7. pH meter 3.2.8. 真空幫(bang)浦 3.2.9. CO2 氣體
3.3. 步驟：
3.3.1. 取粉末培養基溶(rong)于700 ml milli-Q 水中，攪拌使其溶(rong)解。
3.3.2. 稱(cheng)取適量之NaHCO3 粉(fen)末(數量依培養基種類而異，表一(yi))溶(rong)于200ml milli-Q 水中，攪(jiao)拌使(shi)其溶(rong)解，然(ran)后通入(ru)CO2 氣體至飽和(he)，約(yue)3-5 分鐘(zhong)。
3.3.3. 將溶(rong)解且含飽和CO2 之(zhi)(zhi)NaHCO3 溶(rong)液(ye)(ye)(ye)加入(ru)(ru)溶(rong)解之(zhi)(zhi)液(ye)(ye)(ye)體培養基中混合。混后 溶(rong)液(ye)(ye)(ye)之(zhi)(zhi)pH 應(ying)為(wei)7.2-7.4，除非pH 值(zhi)偏差太大，否則不需用(yong)酸堿再(zai)調(diao)整之(zhi)(zhi)。 若為(wei)太堿，可再(zai)通入(ru)(ru)CO2 氣體調(diao)整pH。培養基以真空幫浦通過過濾膜時， pH 會升(sheng)高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無菌(jun)(jun)過(guo)濾膜過(guo)濾滅菌(jun)(jun)，同時分裝(zhuang)至無菌(jun)(jun)容(rong)器中(zhong)，標示培養 基(ji)種類、日(ri)期、瓶號等，貯存于4 oC。(血清亦(yi)可加入培養基(ji)中(zhong)一(yi)起(qi)過(guo)濾)
3.3.5. 配(pei)制(zhi)之(zhi)培養基配(pei)制(zhi)須作(zuo)生(sheng)長試驗與污染(ran)測試。 ;
4. 配(pei)制培養基(ji)之生長測試
4.1. 材料：
4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish) 4.1.3. methanol 4.1.4. glacial acetic acid
4.1.5. 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)
4.2. 步驟：
4.2.1. 以待測試培(pei)養(yang)基培(pei)養(yang)MDCK cell，接(jie)(jie)種MDCK 細(xi)(xi)胞(bao)(bao)于(yu)6-well plate (或35 mm TC dish) 中，每個(ge)well 接(jie)(jie)種1 × 102 活細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，同時作對照組(zu)實(shi)驗。4.2.2. 接(jie)(jie)種5～7 天后，在100 倍倒立顯微鏡作觀察細(xi)(xi)胞(bao)(bao)群落之生長(chang)，待細(xi)(xi)胞(bao)(bao)群 落大(da)到可以肉(rou)眼(yan)觀察，而群落間(jian)不互(hu)相接(jie)(jie)觸時即可。
4.2.3. 去除培養(yang)基，加入1 ml Carnoy’s 固(gu)定液(甲醇：冰醋(cu)酸﹦ 3:1)，室溫下靜 置10 min。
4.2.4. 去除(chu)固定液(ye)，水洗二(er)次。
4.2.5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室溫下(xia)靜置染色2-3 min。4.2.6. 去除染液，水洗二次。 ;
4.2.7. 以肉(rou)眼計數群落數，并比較之，若新(xin)配制或新(xin)批(pi)號的培(pei)養基對細胞生長不 佳，則丟(diu)棄之。
抗生素
1. 細胞(bao)庫之細胞(bao)培養(yang)基(ji)不加抗生素
1.1. 培(pei)養(yang)自ATCC 引進之(zhi)細胞(bao)株，培(pei)養(yang)基中不(bu)加抗生素。
1.2. 培養(yang)自(zi)其它(ta)實(shi)驗(yan)室引進(jin)之細胞株，制作token freeze 前培養(yang)基須添(tian)加抗生素，待 token freeze 通過污染測試(shi)后，大量培養(yang)時則(ze)不加抗生素。
2. 寄(ji)送(song)活(huo)細胞時，須將培養液(ye)充滿(man)整個flask 時，則須添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。
3. 若要檢測(ce)mycoplasma，則培養(yang)基內不(bu)可添加gentamicin，因(yin)gentamicin 會抑制(zhi) mycoplasma 生長。
4. 去除細菌(jun)污染之抗(kang)生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后藥(yao)物毒性(xing)會(hui)增強。
5. 抗生素使用種類(lei)與濃度：
工作濃(nong)度(du). 儲存溫度(du). 殺滅細菌(jun)
penicillin 100 units/ml -20℃ G(+) bacteria
streptomycin 100 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria
chlotetracycline 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria
gentamicin 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma amphotericin B 2.5 ug/ml -20℃ yeast and molds nystatin 50 ug/ml -20℃ yeast and molds fungizone 2.5ug/ml -20℃ yeast and molds
血清
1. 血清必須貯(zhu)存于–20 ～ -70 oC，若存放于4℃，請(qing)勿(wu)超過一個月(yue)。如(ru)果一次(ci)無法用完一 瓶(ping)，可將40～45 ml 分裝于無菌50 ml 離心管中，由于血清結凍時體積會增加約10 %， 必須預留此膨脹體積之(zhi)空(kong)間，否則(ze)易發生(sheng)污(wu)染或(huo)容(rong)器凍裂之(zhi)情形。
2. 一般廠商提(ti)供之血(xue)清(qing)(qing)(qing)為無(wu)菌(jun)(jun)，不需再無(wu)菌(jun)(jun)過(guo)濾。若發現血(xue)清(qing)(qing)(qing)有許多(duo)懸浮物，則可將(jiang)血(xue)清(qing)(qing)(qing)加 入培養基內一起過(guo)濾，勿直接過(guo)濾血(xue)清(qing)(qing)(qing)。
3. 瓶裝(zhuang)(zhuang)(500ml) 血清解凍步驟(zou)(逐步解凍法): -20 oC 或–70 oC 至(zhi)4 oC 冰(bing)箱溶解一(yi)天，至(zhi)室 溫(wen)下(xia)全溶后再分(fen)(fen)裝(zhuang)(zhuang)，一(yi)般以(yi)50 ml 無菌離心管可(ke)分(fen)(fen)裝(zhuang)(zhuang)40～45 ml。在溶解過程中須(xu)規則搖 晃(huang)均勻(小心勿(wu)造成氣泡)，使溫(wen)度(du)與成分(fen)(fen)均一(yi)，減(jian)少沈淀(dian)的發生。勿(wu)直接(jie)由–20 oC 直接(jie) 至(zhi)37 oC 解凍，因溫(wen)度(du)改變(bian)太大，容易造成蛋白質凝(ning)結而(er)發生沈淀(dian)。
4. heat-inactivation 是(shi)指56 oC, 30 分鐘加熱已(yi)*解凍之(zhi)(zhi)(zhi)血清。加熱過程(cheng)中(zhong)(zhong)須(xu)規則搖晃均 勻。此熱處理(li)之(zhi)(zhi)(zhi)目的是(shi)使血清中(zhong)(zhong)之(zhi)(zhi)(zhi)補(bu)體(ti)成(cheng)份(complement) 去活化。除非必須(xu)，一般(ban)不(bu)建 議作(zuo)此熱處理(li)，因為會造(zao)成(cheng)沈(shen)淀物之(zhi)(zhi)(zhi)顯著(zhu)增(zeng)多(duo)，且會影響(xiang)血清之(zhi)(zhi)(zhi)品質(zhi)。補(bu)體(ti)參與之(zhi)(zhi)(zhi)反應有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。
5. 勿(wu)將血(xue)清置于37 oC 太久(jiu)(jiu)，若在37 oC 放(fang)置太久(jiu)(jiu)，血(xue)清會(hui)變得混濁(zhuo)，同(tong)時血(xue)清中許多較(jiao) 不穩定之(zhi)成份亦會(hui)因此受到破壞，而影響(xiang)血(xue)清之(zhi)品質。
6. 血(xue)清(qing)之(zhi)沈淀(dian)物
6.1. 凝(ning)絮(xu)物(wu)：發生(sheng)之(zhi)原因(yin)(yin)有(you)許多種(zhong)，但普遍之(zhi)原因(yin)(yin)是血(xue)清(qing)中(zhong)(zhong)之(zhi)脂蛋白(lipoprotein) 變性 及解凍后(hou)血(xue)清(qing)中(zhong)(zhong)存在(zai)之(zhi)血(xue)纖維蛋白(fibrin) 造成，這些(xie)凝(ning)絮(xu)沈(shen)淀(dian)物(wu)不會影響血(xue)清(qing)本 身(shen)之(zhi)品質。若欲減少這些(xie)凝(ning)絮(xu)沈(shen)淀(dian)物(wu)，可(ke)用離心3000 rpm, 5 min 去(qu)除(chu)，或離心后(hou)上 清(qing)液可(ke)以加入(ru)培(pei)養基中(zhong)(zhong)一起過濾(lv)。不建議用過濾(lv)步驟去(qu)除(chu)這些(xie)凝(ning)絮(xu)沈(shen)淀(dian)物(wu)，因(yin)(yin)為會 阻塞過濾(lv)膜(mo)。
6.2. 顯(xian)微鏡下(xia)觀察之(zhi)“小(xiao)黑(hei)點"：通常經過(guo)熱處理之(zhi)血(xue)(xue)清(qing)，沈淀物(wu)(wu)的形成會(hui)(hui)(hui)顯(xian)著的增多。 有些(xie)沈淀物(wu)(wu)在顯(xian)微鏡下(xia)觀察像是“小(xiao)黑(hei)點"，常會(hui)(hui)(hui)誤(wu)認為(wei)血(xue)(xue)清(qing)遭受污染(ran)，而將血(xue)(xue)清(qing) 放在37 oC 中欲培養(yang)此(ci)“微生(sheng)物(wu)(wu)“，但(dan)在37 oC 環境下(xia)，又會(hui)(hui)(hui)使此(ci)沈淀物(wu)(wu)增多，更(geng) 會(hui)(hui)(hui)誤(wu)認為(wei)微生(sheng)物(wu)(wu)之(zhi)增殖，但(dan)以(yi)培養(yang)細菌之(zhi)培養(yang)基檢測，又沒有污染(ran)。一般而言，此(ci) 小(xiao)黑(hei)點應不會(hui)(hui)(hui)影響(xiang)細胞之(zhi)生(sheng)長，但(dan)若懷(huai)疑此(ci)血(xue)(xue)清(qing)之(zhi)品質，應立即停用，更(geng)換另一批 號(hao)的血(xue)(xue)清(qing)。
7. 血(xue)清之(zhi)生長測試 7.1. 材料(liao)：
7.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)
7.1.2. a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 ) 7.1.3. 6-well TC plate (or 35mm TC dish) 7.1.4. methanol 7.1.5. glacial acetic acid
7.1.6. 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013) 7.2. 步驟：
7.2.1. 以(yi)a-MEM with 10 % FBS (已測(ce)試過(guo)) 培養MDCK 細胞于T75 flask 至(zhi)80 % confluency。
7.2.2. 以trypsin-EDTA 處理細胞(bao)(bao)，離心后(hou)，加入適量不(bu)加血(xue)清之(zhi)a-MEM 制(zhi)成細 胞(bao)(bao)懸浮液，并測細胞(bao)(bao)濃度(du)。以不(bu)加血(xue)清之(zhi)a-MEM 稀釋細胞(bao)(bao)濃度(du)為(wei)1×102 活(huo) 細胞(bao)(bao)數/ ml。
7.2.3. 將1 ml 細胞懸浮(fu)液接種入6-well plate 中，并另(ling)加入1 ml 含不(bu)同濃度的血
清(qing)(qing)(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a-MEM，使血(xue)(xue)清(qing)(qing)最終濃度為10 % , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已測試過之血(xue)(xue)清(qing)(qing)同時(shi)進行對照組(zu)試驗(yan)。7.2.4. 37 oC，5 % CO2 培(pei)養箱培(pei)養5-7 天，期間不需更(geng)換培(pei)養基(ji)，待細胞群(qun)(qun)落(luo)大(da) 到可(ke)以肉眼觀察，而群(qun)(qun)落(luo)間不互相接觸即可(ke)。
7.2.5. 去除(chu)培養基(ji)，加(jia)入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸(suan)﹦ 3:1)，室(shi)溫下(xia)靜 置(zhi)10 min。
7.2.6. 去除(chu)固定液，水洗二次。
7.2.7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室(shi)溫下靜置染色2-3 min。7.2.8. 去除(chu)染液(ye)，水洗二次(ci)。7.2.9. 以肉眼(yan)計數群落數
7.2.10. 計(ji)算SPE ( Serum Plating Efficiency )：SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 % 7.2.11. 計(ji)算RPE(Relative Plating Efficiency)：
SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 % 7.3. 比較各濃度血(xue)清培養基之RPE，即可得知待(dai)測血(xue)清對(dui)細胞生長的影(ying)響。7.4. 訂購多量同一批號的優良血(xue)清，置于–70 oC 保存之
