分光光度計測量誤差產生原因(yin)
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分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計是利用物質對光(guang)的選擇性吸(xi)收的特性，以較(jiao)純的單色光(guang)作為入射光(guang)，測定物質對光(guang)的吸(xi)收，從而物質進行定性或定量分(fen)析的儀器。在使用過(guo)程中常常會出(chu)現測量誤差，這些誤差又(you)是如何產生的呢？
1.1復色光(guang)對比(bi)耳定律的偏離
比(bi)耳(er)定律(lv)成(cheng)立(li)的(de)(de)前(qian)提(ti)條件(jian)是(shi)人射光(guang)(guang)是(shi)單色(se)(se)光(guang)(guang)，但是(shi)精(jing)度再高的(de)(de)儀器，即使是(shi)雙單色(se)(se)器的(de)(de)分光(guang)(guang)光(guang)(guang)度計(ji)，也只(zhi)能獲得近乎單色(se)(se)的(de)(de)光(guang)(guang)，無法獲得純單色(se)(se)光(guang)(guang)，它仍然含有狹窄光(guang)(guang)通(tong)帶，具有復(fu)色(se)(se)光(guang)(guang)的(de)(de)性質。而復(fu)色(se)(se)光(guang)(guang)會導致(zhi)比(bi)耳(er)定律(lv)的(de)(de)正或負(fu)偏(pian)離。
固(gu)定(ding)狹(xia)縫的紫外(wai)分光光度(du)計光譜帶(dai)寬(kuan)一(yi)般為1nm或2nm，可(ke)調狹(xia)縫的可(ke)以(yi)做到0.Inm；可(ke)見分光光度(du)計帶(dai)寬(kuan)6nm、snm，甚至(zhi)十(shi)幾(ji)納米。
光譜帶寬應(ying)該是(shi)越(yue)小越(yue)好，但是(shi)隨(sui)著光譜分辨(bian)率的提高(gao)，儀器(qi)的靈敏(min)度降低(di)，所以選擇儀器(qi)時要綜合考慮(lv)各(ge)種條(tiao)件的影(ying)響。當溶液濃度較(jiao)小且單色光較(jiao)純時，可近似認為符合比耳定(ding)律(lv)。
1.2雜(za)散(san)光的影(ying)響
雜散(san)光(guang)(guang)是指(zhi)進(jin)人檢測(ce)器(qi)的處于待測(ce)波長光(guang)(guang)譜帶(dai)寬(kuan)范圍外的其他波長組分，它是光(guang)(guang)譜測(ce)量(liang)中誤(wu)差的主要來源。
產生原因有:分光(guang)光(guang)度計(ji)的(de)色(se)(se)散(san)元件、反射鏡(jing)、透鏡(jing)及單色(se)(se)器內壁灰塵等(deng)。在分光(guang)光(guang)度計(ji)工(gong)作波段(duan)邊緣(yuan)波長(chang)處，由于單色(se)(se)器透光(guang)率、光(guang)源(yuan)輻射強(qiang)度、檢測器靈敏度都(dou)較低，雜散(san)光(guang)的(de)影響更為顯著。
雜散光(guang)(guang)限(xian)制儀器的(de)分(fen)析(xi)上限(xian)可(ke)引起(qi)嚴重的(de)測(ce)量(liang)誤差(cha)，實際工作中，在定量(liang)分(fen)析(xi)時，一(yi)般(ban)在吸(xi)收峰或(huo)其附近處測(ce)量(liang)樣品吸(xi)光(guang)(guang)度(du)，如果(guo)在分(fen)析(xi)波長處含有雜散光(guang)(guang)，這時樣品的(de)透光(guang)(guang)率較(jiao)小(xiao)，而雜散光(guang)(guang)大部分(fen)透過，使測(ce)量(liang)吸(xi)光(guang)(guang)度(du)低于真(zhen)實吸(xi)光(guang)(guang)度(du)。
1.3儀器噪聲對測(ce)定(ding)的影(ying)響
儀(yi)(yi)(yi)器(qi)噪聲也是儀(yi)(yi)(yi)器(qi)的一個重要(yao)指標(biao)，它(ta)表(biao)征儀(yi)(yi)(yi)器(qi)做稀溶液的能力。是疊(die)加在待測量(liang)的分析信號(hao)中的不(bu)需要(yao)的信號(hao)，掃描100%T和0%T線(xian)，可觀察到分光光度計的絕對噪聲水平，如果儀(yi)(yi)(yi)器(qi)噪聲較大，會掩蓋較小的測量(liang)信號(hao)，一般用(yong)噪音的二倍(bei)來(lai)表(biao)示儀(yi)(yi)(yi)器(qi)的靈(ling)敏度。
1.4波長和吸光度(du)準(zhun)確度(du)
樣品的每一個值(zhi)(zhi)都是在一定(ding)的波長下測(ce)得的，如果波長誤差很大，測(ce)出的值(zhi)(zhi)肯定(ding)不(bu)準(zhun)。吸光(guang)度準(zhun)確度也是用(yong)戶(hu)對儀(yi)器的直接要求(qiu)，更應引起足夠的重視(shi)。
國家計(ji)量檢定規程規定雙光束紫外可見分光光度(du)計(ji)透射比準確度(du)為*士(shi)0.6%， B級土(tu)1.0%。
2測(ce)量條件(jian)的選擇
2.1參比溶液(ye)和溶劑的(de)選(xuan)擇(ze)
分(fen)光(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)度(du)(du)計的測量實際上是以通(tong)過參(can)比(bi)池的光(guang)(guang)(guang)強度(du)(du)作為(wei)人(ren)射(she)光(guang)(guang)(guang)強度(du)(du)來測定試樣(yang)的吸(xi)光(guang)(guang)(guang)度(du)(du)，先調節儀器使(shi)透過參(can)比(bi)池溶液的吸(xi)光(guang)(guang)(guang)度(du)(du)為(wei)零，然后讓(rang)同一束光(guang)(guang)(guang)通(tong)過樣(yang)品，使(shi)得吸(xi)光(guang)(guang)(guang)度(du)(du)比(bi)較真(zhen)實地反映待測物質的濃(nong)度(du)(du)，所以參(can)比(bi)溶液的選擇非常重(zhong)要(yao)。
如果僅有待測(ce)物(wu)質與顯(xian)色(se)(se)劑(ji)(ji)(ji)的反應(ying)(ying)產物(wu)有吸收，可用純(chun)溶劑(ji)(ji)(ji)或(huo)蒸(zheng)餾水作(zuo)參比(bi)(bi)溶液(ye)。如果顯(xian)色(se)(se)劑(ji)(ji)(ji)有顏色(se)(se)，并在測(ce)定波長下有吸收，則用顯(xian)色(se)(se)劑(ji)(ji)(ji)溶液(ye)作(zuo)參比(bi)(bi)溶液(ye)，所加人(ren)顯(xian)色(se)(se)劑(ji)(ji)(ji)及其它(ta)試劑(ji)(ji)(ji)的量，與試樣中的加入量應(ying)(ying)一致(zhi)。
如果樣品中其它組分本(ben)身的(de)顏色對(dui)測定有(you)干擾，而(er)所用顯色劑沒(mei)顏色，則用不加顯色劑的(de)樣品溶液作參(can)比液。
正確(que)選擇(ze)(ze)合適的(de)溶(rong)(rong)(rong)劑(ji)(ji)(ji)，對提高分析的(de)準確(que)度起重要作用(yong)(yong)。為減小溶(rong)(rong)(rong)劑(ji)(ji)(ji)中雜質的(de)影響(xiang)，應選擇(ze)(ze)高純度的(de)溶(rong)(rong)(rong)劑(ji)(ji)(ji)；溶(rong)(rong)(rong)劑(ji)(ji)(ji)應不(bu)與待測物(wu)質發生化學反(fan)應；待測物(wu)在溶(rong)(rong)(rong)劑(ji)(ji)(ji)中要有一定的(de)溶(rong)(rong)(rong)解度；在測定的(de)波(bo)長范圍內，溶(rong)(rong)(rong)劑(ji)(ji)(ji)本(ben)身沒有吸收，注(zhu)意常用(yong)(yong)溶(rong)(rong)(rong)劑(ji)(ji)(ji)的(de)最短可(ke)用(yong)(yong)波(bo)長；當用(yong)(yong)揮發性大的(de)溶(rong)(rong)(rong)劑(ji)(ji)(ji)時(shi)，測量(liang)過程中吸收池應加蓋。
2.2測試波長的選擇
當用分光(guang)(guang)光(guang)(guang)度計對溶(rong)液進(jin)行測定(ding)時，首先(xian)需要(yao)選(xuan)擇合適(shi)的測量(liang)波長。選(xuan)擇的依據(ju)是(shi)該被(bei)測溶(rong)液的吸收(shou)曲線。在一(yi)般情(qing)況下(xia)，我們總是(shi)選(xuan)擇最(zui)大吸收(shou)波長作為測量(liang)波長，這樣可以提高靈(ling)敏度。
而(er)在(zai)有些情況(kuang)下(xia)最大吸(xi)(xi)(xi)收(shou)(shou)(shou)峰很尖銳、吸(xi)(xi)(xi)收(shou)(shou)(shou)過大或附近有干擾存在(zai)，就不能(neng)選(xuan)(xuan)最大吸(xi)(xi)(xi)收(shou)(shou)(shou)波長(chang)(chang)，而(er)必須在(zai)保證有一定(ding)靈敏度的(de)(de)情況(kuang)下(xia)，選(xuan)(xuan)擇吸(xi)(xi)(xi)收(shou)(shou)(shou)曲線中的(de)(de)其它波長(chang)(chang)進(jin)行測定(ding)(曲線較(jiao)平(ping)坦(tan)處對應的(de)(de)波長(chang)(chang))，以消除干擾。繪(hui)制吸(xi)(xi)(xi)收(shou)(shou)(shou)曲線是(shi)正確選(xuan)(xuan)擇波長(chang)(chang)的(de)(de)有效手段(duan)和方法。
3、分光光度計的檢(jian)驗小妙招(zhao)
波長準確(que)度的(de)檢(jian)驗
分光光度(du)計在使用過(guo)(guo)程中，由于機械(xie)振動(dong)、溫度(du)變(bian)化、燈絲變(bian)形、燈座松動(dong)或更換(huan)燈泡等原因(yin)，經常會出現刻度(du)盤上(shang)的讀數與(yu)實際(ji)通過(guo)(guo)溶液的波長不符合的現象，因(yin)而導(dao)致儀器靈明(ming)度(du)降低，影響測定結(jie)果的精度(du)，需要(yao)進(jin)行(xing)檢驗。
檢驗波長準確度zuijian單的(de)方法是(shi)用干涉濾光片(pian)或鐠釹濾光片(pian)測量儀器(qi)的(de)吸收(shou)峰值, 如果測出(chu)的(de)值與濾光片(pian)標(biao)準值之差(cha)超出(chu)規(gui)程規(gui)定, 則需要進行波長調(diao)節。
透射比(bi)正確度的檢驗
用(yong)(yong)透射比(bi)標(biao)準(zhun)值分(fen)(fen)別(bie)為10 %、20 %、30 %左(zuo)右的光(guang)譜中(zhong)性濾光(guang)片，可見(jian)光(guang)區分(fen)(fen)別(bie)在440、546、635nm波(bo)長(chang)處，以空氣(qi)為參比(bi)，分(fen)(fen)別(bie)測量各濾光(guang)片的透射比(bi)，紫外光(guang)區用(yong)(yong)重鉻酸鉀溶(rong)液分(fen)(fen)別(bie)在235、257、313、350nm波(bo)長(chang)處，以高氯(lv)酸溶(rong)液為參比(bi)，測量其透射比(bi)。
穩定度(du)的檢驗
在零(ling)(ling)點(dian)不受(shou)光的(de)條(tiao)件下，用零(ling)(ling)點(dian)調(diao)(diao)節器將儀器調(diao)(diao)至零(ling)(ling)點(dian)，觀察(cha)3分鐘讀取透射比的(de)變化(hua)，即為零(ling)(ling)點(dian)穩定性。在儀器測(ce)量范圍兩端向中間靠10nm處(chu)，調(diao)(diao)節零(ling)(ling)點(dian)后，蓋上樣品室蓋(打(da)開光門)，使光電管受(shou)光，調(diao)(diao)節透射比為95%（數(shu)顯儀器調(diao)(diao)至100%）察(cha)3分鐘讀取透射比的(de)變化(hua)，為光電流穩定性。
光的檢驗
可見分光計棱鏡式儀(yi)器在420nm處，光柵式儀(yi)器在360nm處，紫外分光計在220nm處分別用符合(he)規定的(de)截止濾光片，以空氣為參比(bi)，測量其透射比(bi)值，即為儀(yi)器在相應波長下的(de)雜散輻射率。
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